CRISPR-Cas. Una navaja suiza para el diagnóstico

                                        CRISPR-Cas. CC por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). USA

La herramienta CRISPR-Cas promete ser una revolución para la edición genómica. Sin embargo, no solo sirve para eso. La nueva revolución que nos traerá será una cambio de paradigma para el diagnóstico genómico.

En estos momentos, el diagnóstico genómico en general se realiza mediante dos grandes tipos de métodos. El de alto volumen, que implica secuenciación de una parte o todo un genoma o del ARN para encontrar las diferencias que nos permitan diagnosticar enfermedades. El segundo grupo de técnicas están apoyadas por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por el cual Kary Mullis ganó el premio Nobel de Química en 1993. 

                        Kary Mullis. Premio Nobel en Química 1993. CC por Dona Mapston 

El PCR consiste en una fase en la que alineamos "cebadores" de ADN, que son fragmentos pequeños de ADN que se unen a los extremos del fragmento que queremos amplificar; otra fase en la cual utilizamos una enzima (polimerasa) para sintetizar el ADN que se encuentra entre ambos cebadores y una fase final en la que calentamos todo para que se separe y volvamos a empezar.

PCR. CC ASA 4.0 por Enzoklop, Wikimedia commons

Esta reacción nos permite amplificar exponencialmente cualquier ADN, lo cual ha permitido crear cebadores específicos para detectar diversas enfermedades. Por ejemplo, es la base para el diagnóstico actual del COVID-19.

Sin embargo, esta técnica tiene varias limitaciones. La primera es que requiere ciclos de calentamiento y enfriamiento para poder amplificar la región de ADN, lo cual requiere equipo especializado. La segunda es la relativa poca sensibilidad que posee. La tercera es la facilidad con que se puede contaminar la reacción. 

El sistema CRISPR puede lograr superar muchas de estas desventajas. Podemos utilizar la exquisita especificidad de una guía de ARN (mejor que un cebador de ADN) para localizar la secuencia que queremos y utilizar un reportero fluorescente para detectar la actividad de las Cas. Asimismo, el hecho de que no se necesite calentar y enfriar la muestra permite crear sistemas que pueden ser usados en lugares que no disponen de equipos sofisticados. 

Es por ello que muchos grupos de investigación en el mundo se encuentran trabajando para crear sistema que usen tiras reactivas o tubitos que permitan detectar en el campo patógenos como el Zika, Dengue o Ébola.

En nuestro grupo estamos trabajando en sistemas para detectar COVID-19 e Influenza usando un sistema CRISPR-Cas de bajo costo y mayor rapidez que el que se usa actualmente. Próximamente les compartiremos los resultados.

Dra. Vilma Maldonado

Dr. Jorge Melendez-Zajgla

CRISPR. Un premio Nobel bien merecido

El último premio Nobel de Química se le otorgó a las doctoras Jennifer Duodna y Emmanuelle Charpentier por el descubrimiento del uso de la herramienta CRISPR-Cas para la edición genómica. Este es un hito con un gran significado biológico, no solo por la importancia de un premio de esa magnitud para dos mujeres (lo cual no es muy frecuente), sino por las posibilidades que se abren.

Jennifer Doudna y Emanuelle Charpentier (CC, The Royal Society, Bianca Fioretti, Hallbauer & Fioretti,)

CRISPR (por sus siglas en inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) fue creado por bacterias hace millones de años como una herramienta de batalla contra los virus (fagos) que las aquejan. Es por ende la parte principal de su sistema inmune, en particular para otorgarles inmunidad adquirida.

Este sistema está compuesto por dos elementos generales: una nucleasa (una proteína que puede cortar ácidos nucléicos) llamada Cas (CRISPR-associated) y una hebra de ARN guía. Dado a que este sistema ha evolucionado por millones de años, existen una multitud de enzimas y ARNs guías en las diferentes especies de bacterias. El 50% de las bacterias y el 90% de las arqueas tienen este sistema.

CRISPR-Cas funciona de una manera inesperada. Como se trata de un sistema de inmunidad adquirida, la bacteria posee una serie de "espaciadores" palindrómicos en su ADN entre los que se encuentran fragmentos aislados de virus que previamente infectaron a la bacteria (la adquisición de estos fragmentos es una historia un poco más complicada). Al infectarse por un virus, se produce un ARN guía a partir de estos fragmentos y sus espaciadores. Este ARN guía forma un complejo con la proteína Cas y siendo complementario a una región específica ADN del virus, lleva a la nucleasa Cas al virus. Esta nucleasa corta el ADN, frenando la reproducción del fago.

                                                 Proteína Cas9. (CC por los National Institutes of Health)

  A partir de estos elementos se creo un sistema sintético en el cual se aislaron los genes de la proteína Cas (hay varias variedades, algunas de ellas cortan específicamente, otras no tan específicamente) y se produjeron los ARNs guías dirigidos al sitio específico del ADN de interés. Estos genes se introducen en células de cualquier especie (se ha logrado introducirlos en diversos vertebrados, incluso en células humanas) para "editar" el genoma de una manera directa. Como podemos crear las guías que de manera artificial, podemos generara una serie gigantesca de guías para muchas de los genes que queremos editar.

Dra. Vilma Maldonado

Dr. Jorge Meléndez-Zajgla